MicroRNA与siRNA：     

  MicroRNA（miRNA）即为长度为22nt左右的非蛋白编码的调控小RNA家族。miRNA广泛存在于真核生物中，不具有开放阅读框架，不编码蛋白质，一般长20-24nt，miRNA的转录产物是发夹状结构Pri-miRNA，在RNaseⅢ酶切后以双链形式存在，最后释放互补链，miRNA成熟。成熟的miRNA 侧翼序列则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA基因是一类高度保守的基因家族，表达具有时序性和组织特异性。miRNA对生长发育进行更为重要的调控作用。同时，科学家们也发现人类基因组中大约有255个编码miRNA基因，约占人类基因数的1%，但尚不清楚其功能。最近科学家发现小RNA 与‘epigenetic’现象有联系。所谓epigenetic 是指并不涉及遗传序列的特征性的遗传改变。有人已试图将小RNA 用于抗病毒治疗之用,认为它们有可能抑制HIV21 和灰质类病毒丙型肝炎病毒的转录,以及也可能用于肿瘤的治疗。

 

1、二者的长度都约在22nt左右。

2、二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。

3、二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在。

4、二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。

5、miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。

 

1、根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。

2、结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。

3、Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。

4、在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3′-UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。

5、在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。

6、miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。

 

 

  我们采用美国进口的第三代microRNA抑制表达慢病毒表达载体，能够高效表达出不对称发夹装结构shRNA，这种shRNA能生成 MicroRNA抑制剂，能特异性抑制内源性microRNA的功能，详情请见慢病毒载体信息。

 

1、含组成型H1启动子，持久且稳定表达MicroRNA抑制剂.，实现永久性MicroRNA knockdown效应。

2、由于microRNA慢病毒载体能够被包装成microRNA慢病毒颗粒，用于感染分裂期和非分裂期细胞，如原代细胞、难于转染的细胞或干细胞等。

3、这种MicroRNA knockdown效应能够传代，特别适合药物筛选细胞株、病理组织与转基因动物研究。

4、能够明显特异性抑制内源性MicroRNA的表达。

5、copGFP与Puro双标签形式，可用于稳定阳性细胞株流式或抗性筛选。

6、MicroRNA抑制表达载体文库可用于高通量表型筛选研究。

 

      

 

 

 

 

 

我们使用的载体能持续表目的shRNA， 这种shRNA的上下部分不完全对称，如左图， 上部分（灰色）不包含内源性miRNA， 而下部分经过剪切之后成短的、单链的microRNA抑制剂，能与内源性microRNA的靶mRNA序列完全互补结合，竞争性地抑制内源性microRNA的调节功能，从而使蛋白表达水平上调等。

  目前我们能够为客户提供包括miRNA表达谱分析、慢病毒载体构建、测序、慢病毒生产等一站式服务。我们的服务将为客户最大限度地提高效率和节省时间。另外，我们的技术专家将为您的实验提供全程支持，请Email至yanggy@genechem.com.cn。

  同时，我们为客户提供miRNA抑制表达慢病毒载体构建服务的个性化定制服务方案，包括根据miRNA抑制序列、mRNA特征、目的细胞特征与客户需求，我们会为客户选择最合适的慢病毒载体、启动子、荧光标记或选择性抗性标记，插入miRNA抑制序列，使其大量表达，客户也可以根据我们的载体信息自行挑选；同时又可以根据客户的需要，可在重组慢病毒载体中加入各种报告基因或标签（或进行改造），从而构建miRNA knockdown慢病毒载体。

  我们有标准的客制化服务流程，同时我们也会根据客户需求，为每个客户度身定制各种MicroRNA knockdown慢病毒载体构建服务方案。如有需要，欢迎致电021-34512321咨询。

 

 

  我们可以根据客户需求构建各种浓度的超纯纯化miRNA抑制表达慢病毒载体。构建的重组miRNA抑制表达慢病毒载体可直接转染细胞，用于瞬时转染；也可以包装成病毒颗粒，用于稳定长效表达。

 

                   内毒素<10EU/mg质粒DNA

                   RNA<0.2ug/mg

                   基因组DNA<2ug/mg

                   蛋白<3ug/mg

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 为了验证microRNA重组载体的miRNA抑制剂表达水平，六种3μg载体转染至HEK293细胞。培养48小时候之后，裂解细胞和提取总RNA，RNA样本反转录成cDNA，最后用qPCR方法分析miRNA抑制剂的表达水平。

 

 

 

反转录的cDNA 1:50稀释，取1μl再加引物等制备成6μl qPCR反应体系，未转染载体的细胞作为阴性对照，结果如左图所示。

 

 

 

  MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。 对于分裂活跃的细胞，比如Hela、293细胞，MOI=1时，80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。我们建议通过比较不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），选择适合的MOI进行实验。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

miRNA抑制剂表达载体转染HEK-293细胞，培养24小时之后加入8-50 μg/ml终浓缩嘌呤霉素，加入 嘌呤霉素24小时之后的结果如左图所示，对照细胞在嘌呤霉素筛选全部死亡。

 

 

 

用Lenti-miR-29a（过表达）慢病毒、miRZip-29a（Knockdown）慢病毒和阴性对照感染U937细胞，用WB检测目标蛋白的表达水平，如左图所示：miR-29的过表达下调目标蛋白；miRZip-29a抑制内源性miR-29a的表达，明显上调目标蛋白表达水平。

 

 

 

 

 

 

为了研究miR-21(癌基因发生相关miRNA)和miR-145（抑制肿瘤相关miRNA）在乳腺癌中表达的意义，分别用miRZip-21慢病毒、miRZip-145慢病毒与对照慢病毒感染MDA-MB-231乳腺癌细胞，再用Matrigel做细胞浸润实验来检测MDA-MB-231乳腺癌细胞的浸润表型。

 

 

 

 

 

 

20小时之后，将已经侵入并贴附于微孔膜下层的细胞固定并0.05%结晶紫染色，显微镜下直接观察穿过膜的细胞数。右图分别为对照病毒、miRZip-21 knockdown慢病毒和 miRZip-145 knockdown慢病毒处理过的穿过膜细胞视野图。

 

 

 

 

 

 

 

 

实验结果表明：对阴性对照相比，miRZip-21 knockdown慢病毒表达mir-21抑制剂能抑制80%的癌细胞生成；而miRZip-145能促进60%癌细胞生成。另外， miRZip-145慢病毒表达抑制内源性miRZip-145从而调节靶蛋白癌基因c-Myc的表达，WB结果如图所示：

 

 

1、Katey J. Rayner, Yajaira Suárez, Alberto Dávalos, Saj Parathath, Michael L. Fitzgerald, Norimasa Tamehiro, Edward A. Fisher,Kathryn J. Moore, Carlos Fernández-Hernando. miR-33 Contributes to the Regulation of Cholesterol Homeostasis. Science. 2010 Jun 18;328(5985):1570-3.

2、Su X, Chakravarti D, Cho MS, Liu L, Gi YJ, Lin YL, Leung ML, El-Naggar A, Creighton CJ, Suraokar MB, Wistuba I, Flores ER. TAp63 suppresses metastasis through coordinate regulation of Dicer and miRNAs. Nature. 2010 Oct 21;467(7318):986-90.

3、Hassan MQ, Gordon J, A, Beloti MM, Croce CM, van Wijnen AJ, Stein JL, Stein GS, Lian JB. A network connecting Runx2, SATB2, and the miR-23a~27a~24-2 cluster regulates the osteoblast differentiation program. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Oct 27. [Epub ahead of print]. (PDF) »

4、Xia H, Cheung WK, Sze J, Lu G, Jiang S, Yao H, Bian XW, Poon WS, Kung HF, Lin MC. miR-200a regulates epithelial-mesenchymal to stem-like transition via ZEB2 and beta-catenin signaling. J Biol Chem. 2010 Nov 19;285(47):36995-7004. (PDF) »

5、Wilson KD, Hu S, Venkatasubrahmanyam S, Fu JD, Sun N, Abilez OJ, Baugh JJ, Jia F, Ghosh Z, Li RA, Butte AJ, Wu JC. Dynamic MicroRNA Expression Programs during Cardiac Differentiation of Human Embryonic Stem Cells: Role for miR-499. Circ Cardiovasc Genet. 2010 Aug 23. [Epub ahead of print].

6、Konstantinos J. Mavrakis, Andrew L. Wolfe, Elisa Oricchio, Teresa Palomero, Kim de Keersmaecker, Katherine McJunkin, Johannes Zuber, Taneisha James, Aly A. Khan, Christina S. Leslie, Joel S. Parker, Patrick J. Paddison, Wayne Tam, Adolfo Ferrando & Hans-Guido Wendel. Genome-wide RNA-mediated interference screen identifies miR-19 targets in Notch-induced T-cell acute lymphoblastic leukaemia. Nature Cell Biology 12, 372 - 379 (2010).

7、Li QQ, Chen ZQ, Cao XX, Xu JD, Xu JW, Chen YY, Wang WJ, Chen Q, Tang F, Liu XP, Xu ZD. Involvement of NF-kappaB/miR-448 regulatory feedback loop in chemotherapy-induced epithelial-mesenchymal transition of breast cancer cells. Cell Death Differ. 2010 Aug 27. [Epub ahead of print].

8、Angelo Veronese, Laura Lupini, Jessica Consiglio, Rosa Visone, Manuela Ferracin, Francesca Fornari,Nicola Zanesi, Hansjuerg Alder, Gemma DElia, Laura Gramantieri, Luigi Bolondi, Giovanni Lanza,Patrizia Querzoli, Adriano Angioni, Carlo M. Croce, and Massimo Negrini. Oncogenic Role of miR-483-3p at the IGF2/483 Locus. Cancer Research 70, 3140, April 15, 2010. (PDF) »

9、Lovén J, Zinin N, Wahlström T, Müller I, Brodin P, Fredlund E, Ribacke U, Pivarcsi A, Påhlman S, Henriksson M. MYCN-regulated microRNAs repress estrogen receptor-alpha (ESR1) expression and neuronal differentiation in human neuroblastoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Jan 26;107(4):1553-8. (PDF) »

10、Hasan Rajabi,Caining Jin,Rehan Ahmad,Andrew Cain McClary,Maya Datt Joshi and Donald Kufe. Mucin 1 Oncoprotein Expression Is Suppressed by the miR-125b Oncomir. Genes and Cancer Jan 2010, vol. 1 no. 1 62-68. (PDF) »

11、Greene SB, Gunaratne PH, Hammond SM, Rosen JM. A putative role for microRNA-205 in mammary epithelial cell progenitors. J Cell Sci. 2010 Feb 15;123(Pt 4):606-618. (PDF) »