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微芯片电泳在二代测序(NGS)文库质控的应用

微芯片电泳在二代测序(NGS)文库质控的应用



随着测序价格不断降低,NGS的应用现在可以说是如日中天了,市场中主流NGS系统,如Hiseq,Solexa,454等,越来越多的进入到大家的视野中。为了得到良好准确的测序结果,NGS前要求了解测序文库样品的尺寸分布和浓度,以提高测序的准备性、减少测序过程中不必要的尝试、降低测序成本。

传统的方法是使用琼脂糖凝胶电泳获得文库的尺寸分布,文库的浓度信息则是通过实时荧光PCR或分光光度计获得。这样的操作需要一系列的步骤、繁琐费时、效率低下、成本居高不下。

另外,随着测序技术的成熟,需要进行质量控制的文库数量大大增多!

本文承接上文,继续介绍微芯片电泳在NGS文库构建中样品分析的应用,以期为大家提供一种操作简单、自动化程度高、高通高、成本可接受的方法。

分析方法(与实时PCR 的浓度定量结果的比较):

1、利用SMARTer Ultra Low RNA kit 制备cDNA 扩增产物得到小鼠的TotalRNA

2、根据Illumina 公司的方法,分享cDNA 扩增产物后,使用TruSeq DNA sample prep kit 制备NGS 文库

3、使用微芯片电泳系统及自带弥散(smear)分析软件分析同一文库,同时对浓度进行定量

4、微芯片电泳系统的浓度定量结果和同一样品的实时PCR(GVP-9600 qPCR)结果进行比较

图2. NGS 流程和MultiNA 文库质量控制的应用范围

结果讨论:

在NGS文库的质量控制过程中,使用微芯片电泳的smear分析软件能够计算出文库的预计平均大小、浓度和摩尔浓度(下图)。通过与实时PCR 的定量进行比较,可知MultiNA 的定量浓度定量结果稳定(下表)。

 Library No. MultiNA (nmol/L)  GVP-9600 (nmol/L) Ratio (MultiNA/GVP-9600)
1 154.6 167.3 92.40%
2 127.0 145.1 87.50%
3 54.1 57.8 93.60%
4 272.4 292.3 93.20%
5 187.3 226.8 82.60%
6 207.5 229.3 90.50%
7 230.3 256.8 89.70%
8 157.0  181.9 86.30%
  Average 89.475% (CV 4.3 %)

在小鼠的RNA 测序结果中,也得到了足够的读取长度和Index标签序列的各文库间稳定的读取率(下表)。

簇密度读取数

(过滤处理后)

548 K/mm2

143.3 M reads

总读取数

≧Q30 比率

151.5 M reads

95.90%

 4 个文库的读取率  21.2% - 26.2%(4个文库/用Index
标签序列对1个通道排序:理论值25 %)
   

注:文库制备时如果没有进行PCR,可能无法根据文库的分布数据得到理想的检测灵敏度。

由上述结果可知,不仅可以在MultiNA 的文库质量控制中确认大小分布,还能够在常规分析中同时进行定量。使用MultiNA可最多对108 个文库自动进行电泳和分析。并且,实际操作时间可缩短10~20 分钟。特别是NGS 文库有所增加时,将MultiNA应用到文库质量控制中,可快速简便地进行质量控制。

MultiNA微芯片电泳系统进行NGS文库质量控制的优点:







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