在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA； 也可由载体直接表达发卡结构小干扰RNA (small hairpin RNA, shRNA)。通过构建RNAi慢病毒表达载体制备shRNA，已成为进行RNA干扰实验的最常用手段之一。

  目前为了感染原代细胞和难感染的细胞系或者在动物水平进行RNAi，研究科学家更多的选择了慢病毒载体。利用慢病毒构建的shRNA载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，lentivirus－shRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

 

 

  shRNA慢病毒载体能用于分化细胞或静息型哺乳动物细胞的转染，包括难于转染的原代细胞、干细胞、神经细胞和内皮细胞等，另外，我们的载体也可以用于knockdow动物和转基因小鼠。 

  与化学合成的siRNA相比， 利用慢病毒构建的shRNA载体转染细胞后能够避免合成的siRNA非有效转染造成的残余和损伤。慢病毒带来的高效和无压力转染极大提高了目的基因沉默后表型分析的likelihood值。  

  包装成慢病毒后感染细胞，可以整合到受感染细胞的基因组，稳定长效表达miRNA, 这种RNA干扰具有可遗传性，以便用于筛选稳定细胞模型用于长期的研究和观察。

 

 

 

  我们采用的美国进口第三代HIV或FIV来源的慢病毒载体属于自我灭活型载体，在长效稳定表达siRNA的同时又能保证高度安全，详情请参见慢病毒载体信息，我们的shRNA慢病毒载体优势有：

1、含有H1/U6 RNA聚合酶Ⅲ启动子的HIV慢病毒载体保证能包装出高滴度的慢病毒；

2、RNA单启动子系列高效表达shRNA，而RNA双启动子直接表达双链siRNA；

3、通T2A肽链linker基因同时表达GFP和Puro两个标签，后续细胞筛选更容易；

4、多种能表达报告基因的启动子、含多个MSC位点或LCS无连接酶克隆位点、多种报告基因及抗性基因，选择更灵活；

5、载体信息具有可追溯性，每种载体都具有对应的国外参考文献及数据，便于文献发表；

 

   

  HIV-1来源的pSIH系列shRNA慢病毒载体来源于能用于美国临床基因治疗的慢病毒， 专利号为美国Dr. J. G. Sodroski 的US patent #5,665,577 和 #5,981,276。 所以，我们的shRNA慢病毒载体将生物安全性保证到了最大程度，是因为：

 

U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA茎环结构（stem loop）。

 

3’ LTR区域删除了U3，使其不再有启动/增强活性，成为自灭活（self-inactivating, SIN）载体，即整合到细胞基因组后，不会产生新的子代病毒，也降低了对周围基因的意外激活。

 

采用杂合型RSV的增强子/启动子-R/U5’长末端重复序列，这样病毒转录时不依赖tat的存在，去除了HIV的tat基因表达。，tat在HIV-1基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用。

 

仅保留了三个HIV-1病毒包装、复制与转导必需基因（gag, pol, rev) ，因其缺乏HIV­-1增强子启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出HIV RNA 。

 

因为HIV-1表达的包装质粒都缺乏包装信息，所以，慢病毒颗粒不具有自我复制能力。

 

慢病毒颗粒实为假病毒颗粒，只表达目的基因。

 

限制病毒成为野生型的可能性。

 

 

 

   

  目前我们能够为客户提供包括RNAi靶序列设计、慢病毒载体构建、测序、慢病毒生产等一站式服务，我们的服务将为客户最大限度地提高效率和节省时间。另外，我们的技术专家将根据客户提供背景资料共同探讨服务的可行性和技术路线，请Email至yanggy@genechem.com.cn.

   

  同时，我们为客户提供shRNA慢病毒载体构建服务的个性化定制服务方案：

1、根据目的mRNA序列，我们的专业人士使用专业siRNA设计软件，为客户设计出3-4条 RNA干扰靶序列，或根据客户需求，设计更多RNAi靶序列；

2、针对不同的靶细胞，不同的病毒载体感染效率有差别。我们会帮客户先进行预试和筛选出最合适的载体，客户也可以根据经验自行挑选出合适的载体；

3、可以根据客户的需要，可在重组慢病毒载体中加入各种报告基因、各种抗性标签或进行改造，从而构建shRNA慢病毒载体。

  虽然我们有标准的客制化服务流程，但是我们会根据客户需求，为每个客户度身定制各种shRNA慢病毒载体构建服务方案。如有需要，欢迎致电021-34512321 咨询。

 

 

 

 

   

  我们可以根据客户需求构建4条以上的RNAi靶序列以及其各种浓度的超纯纯化shRNA慢病毒载体。构建的重组shRNA慢病毒载体可直接转染细胞，用于瞬时转染；也可以包装成病毒颗粒，用于shRNA的稳定长效表达。

 

     内毒素<10EU/mg质粒DNA

     RNA<0.2ug/mg

     基因组DNA<2ug/mg

     蛋白<3ug/mg

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

  您购买一套克隆（针对一个基因的不同位置设计3-4条RNAi靶序列）， 在转染效率>80%的前提下，我们保证至少有1-2个载体有效（可以达到至少70%转录水平的RNA干扰）。

 

 

 

 

HEK-293 cells were transfected with either pSIH1-H1-copGFP or pGreenPuro™ shRNA expression vector, and puromycin (8 – 50 ug/ml final concentration) was then added to the cells 24 hours after transfection. The pictures were taken 24 hour after the initiation of the puromycin treatment.

 

 

 

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