细胞划痕实验（Wound Healing)是一种操作简单，经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合，在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程，是研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。

   划痕实验中，检测目标为感染病毒后表达荧光蛋白的目的细胞[不表达荧光蛋白也可以，但是图片得视觉效果不如表达荧光蛋白] （生长于96孔板中）。用专用的划痕工具制造划痕，细胞成像系统识别带绿色荧光的细胞并拍照（即读板）。然后通过软件对同一视野细胞迁移0h和x h（x为实验细胞合适的迁移时间点[时间太早，划痕愈合的效果不明显，时间太长，不同组别的划痕都愈合完成，组间看不到差异，推荐时间点为0h、8h、16h、24h、36h、48h] ）后图像进行分析处理，计算出实验细胞在x h的迁移面积。

96孔细胞划痕仪

二、实验材料

1.主要试剂

胎牛血清、基础培养基、胰酶、PBS

2. 主要仪器

生物安全柜、荧光显微镜、离心机、CO2培养箱

三、实验步骤

（1）   将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；

吸弃培养基

PBS清洗

加入胰酶

终止消化

收集细胞

离心获取沉淀

细胞计数仪 （上海吉盛医学科技有限公司提供  QQ:1711332989）

（2）   根据细胞大小决定铺板细胞密度（大多数细胞铺板数设定为50000 cell/well，以次日细胞达到90%以上汇合度为准[细胞铺的太多，太挤，连原本细胞形态都会看不清。划的时候，也很容易划不干净，而且划完以后，两边会挂有一团团细胞，使两边边界不清晰。不同细胞，形态大小不一，铺板细胞量自然也就不一样，想要找出铺板最佳细胞量，最快捷的方法就是铺梯度。96孔板，那么多孔，足够一次铺好几个密度梯度了（3万，5万，10万，随便试） 。37℃、5%CO2培养箱培养，每组3复孔，培养体系为100 μL/孔。

划痕铺板

铺板后细胞

（3）   第二天换低浓度血清培养基.

次日细胞状态

划痕仪准备一（上海吉盛医学科技有限公司生产制造  QQ:1711332989）

划痕仪准备二  （上海吉盛医学科技有限公司生产制造  QQ:1711332989）

划痕  （细胞迁移-划痕实验工具单页.pdf）

（4）   使用PBS轻轻漂洗2-3遍[划完以后，痕中间和培养液中遗落少量细胞，是可以通过清洗去除的（如果太多，就别挣扎了，重新再来吧），有些是已经被划动了，但没有完全划掉，这时候清洗个两三次，清洗的时候轻拍96孔板，已经被划动的贴壁不牢的细胞大多数会别洗掉。不过，对于一些本身就容易脱落的细胞，就不能这样洗了，只能“温柔以待”，以免细胞全被洗没了。] ，加入低浓度血清培养基（如1% FBS）[使用低浓度的培养基是为了防止细胞增殖对划痕结果的影响] ，0 h拍照。

清洗

低浓度血清培养基培养

（5）   37℃、5% CO2培养箱培养，根据愈合程度选择合适时间用细胞成像设备扫板。

（6）   分析迁移面积。

四、划痕数据分析概述

迁移面积=x h的细胞面积-0 h的细胞面积。

五、吉凯划痕数据分析步骤[不同的细胞成像设备使用不同的分析方法，八仙过海各显神通吧，但是整体思路就是比面积、比宽度] 

（1）   在0 h和x h对目标96孔板进行扫描读板，获得扫描图片；

下图为针对同一视野在迁移0 h和20 h后获得的扫描图像示例（细胞为H1299）：

（2）   用YOKOGAWA CQ1激光共聚焦细胞分析仪或者带有分析功能的倒置显微镜（吉盛医学提供）对扫描图片进行分析，自动获得数据获得细胞面积。         

（3）   计算迁移面积=（S3+S4）-（S1+S2）